表观遗传学研究已经证实了特定基因区域的DNA甲基化修饰对于染色体构象、基因表达调控机制有着重要影响，而全基因组DNA甲基化研究将是表观基因组学最为关注的内容之一。

Bisulfite处理能够将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来，再结合高通量测序技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。

特定物种的高精确度甲基化修饰模式的分析，必将在表观基因组学研究中具有里程碑式的意义，并且为细胞分化、组织发育等基础机制研究，以及动植物育种、人类健康与疾病研究奠定基础。

技术优势：

■单碱基精确度：精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

■里程碑式的研究：特定物种的表观基因组学研究的重要内容，适用于所有具有精确基因组图谱的物种。

实验流程：

● 基因组DNAA超声打断至100-500bp的片段

● DNA片段末端修复、3’端加A碱基，连接测序接头。

● 采用 EZ DNA Methylattion-Gold kit 进行 Bisulfite 处理

● 脱盐处理，PCR扩增后进行文库片段大小选择。

● 合格的文库用于上机测序。

信息分析流程图：

生物信息分析：

1. Data Clean

测序结果进行去污染，去接头处理。根据测序产生的序列文件*.fq 统计read

长度，read数量，数据产量。

2. 标准信息分析

2.1 Bisulfite-seeq 序列与参考序列的比对

在信息分析过程中，首先将每一对reads中正链reads上的C碱基转换为T碱基，而反链 reads中的G碱基转换为A碱基。在此基础上使用SOAP软件，将reads与参考基因组序列进行比对，唯一比对reads将用于甲基化信息的分析。数据比对统计结果如下：

2.2 C碱基测序深度的累积分布

甲基化C碱基在基因组上的分布包含三种形式（CG, CHG和CHH，其中H代表A 或T或C碱基）。下述图表中反映了三种不同分布类型的C碱基的测序深度累积分布。其中横轴表示C碱基测序深度，纵轴表示一定测序深度下C碱基的累积比例( copynum <=1.5即uniquely mapped reads的判断标准之一)。

碱基测序深度的累积分布图

2.3 不同reads测序深度下的基因组覆盖度

横轴表示测序深度，纵轴表示特定测序深度下所对应的基因组覆盖度。

2.4 计算C碱基的甲基化水平

每一个甲基化C碱基的甲基化水平均按如下公式进行计算：100*reads/total reads（例如：CpG位点的甲基化率=100*支持CG甲基化的reads/支持甲基化的 reads+支持非甲基化的reads）全基因组平均甲基化水平反应了基因组甲基化图谱的总体特征。

Average methylation level for C, CG, CHG and CHH

Pattern

 

C

 

CG

 

CHG

 

CHH

 

Mathylation level

 

5.00

 

80.88

 

4.89

 

1.22

 

2.5 全基因组甲基化数据分布趋势

甲基化C碱基中CG, CHGG与CHH 的分布比例

不同分布类型的甲基化C位点在不同物种基因组中出现比例不同，因此，各类型mC( mCG、mCHG和mCHH ) 的位点数目，及其在全部mC的位点中所占的比例(例：mCHG所占比例= mCHG数目/mC的总数)，在一定程度上反映了特定物种的全基因组甲基化图谱的特征。

不同分布类型甲基化 C 的数量及比例

Pattern

 

mCG

 

mCHG

 

mCHH

 

Number

 

1,409,380

 

4,890

 

47,583

 

Proportion

 

96.41

 

0.33

 

3.25